基于质粒的mRNA疫苗以及病毒载体技术，处于对抗癌症、心血管疾病、免疫和传染病的前沿。为了充分发挥其潜力并使尽可能多的患者受益，我们需优化生产流程以达到更高效率，其中的一个关键步骤就是质粒的生产。但传统的生产方法存在质粒产率低，且需要复杂纯化方案的劣势，今天，我们将为大家带来Cobetter Pultrix™ XQ膜吸附器高效质粒纯化解决方案的介绍。
工艺挑战
目标质粒仅占大肠杆菌裂解后总物质的3%左右，且许多杂质与质粒一样带负电荷、大小相似，这导致质粒纯化非常困难，而最终纯化后的超螺旋质粒必须符合监管机构设定的大于90%的纯度标准。
一方面质粒比蛋白大很多，对于传统层析填料而言，会因其尺寸较大无法进入填料的死端孔结构导致结合载量偏低、传质缓慢。另一方面，由于进料粘度和潜在污垢，质粒体积增大也会显著影响填料柱的压差和处理时间。
尽管传统层析填料工艺存在许多缺陷，却仍应用于大规模纯化工艺中。然而，随着生产工艺及其产品的更新迭代，质粒生产厂家也正考虑通过使用对流介质（即膜、整体柱等）产品来加强色谱步骤，以提高生产效率、增加总产量。
Cobetter解决方案
与传统树脂相比，Pultrix™ XQ膜吸附器性能有显著改进。其大孔膜结构产生的对流通道、高密度的季铵结合位点以及快速的传质效率，使Pultrix™ XQ膜吸附器的结合位点在高流速下也能快速捕获较大的目标分子（如质粒），同时达到GMP生产所需的目标纯度。因此使用Pultrix™ XQ膜吸附器能使生产率（g/L/hr）显著提高。
我们通过在裂解液中添加适量P3溶液（或适量的NaCl固体）澄清后直接使用XQ膜按结合载量～8mg/ml进行质粒捕获，通过洗脱得到纯质粒，能将裂解液中大于99.99%的RNA进行去除。实现在不需要使用RNase或CaCl2的情况下去除RNA杂质，也无需裂解澄清液的浓缩换液操作，进一步降低超滤对质粒构象的影响。Pultrix™ XQ膜吸附器纯化后的质粒纯度≥99%（sc质粒＞90%），收率＞80%，每个裂解液捕获周期运行时间仅为30分钟（按照RT=6s，运行流速10 MV/min计算）。
除性能外，安装简单、可扩展的囊式设计还减少了前处理时间和占地面积，从而能满足不同生产环境下的操作需求，无需装柱和测柱效，能方便、快速使用。
总的来说，生产效率的提高和简单的操作使得Pultrix™ XQ膜吸附器（层析）成为质粒生产的优异解决方案。
案例分享
Pultrix™ XQ膜吸附器捕获工艺起始原料为大肠杆菌裂解液。
与带更强电荷的质粒相比，RNA与阴离子交换介质的结合较弱。因此，进行Pultrix™ XQ膜吸附器捕获之前，需在裂解液中添加盐（例如适量补加P3溶液）以获得更佳电导条件，使RNA等杂质在Pultrix™ XQ膜吸附器上样过程中流穿，而质粒高载量结合，并在随后的洗脱步骤中以高纯度质粒洗脱。
这样就可以实现在不需要RNase或CaCl2沉淀RNA的情况下直接对裂解液中的质粒进行捕获。进一步研究发现，在适宜的盐浓度条件下，裂解液连续上样过程中，由于竞争吸附关系，开环质粒会先于超螺旋质粒流穿，因此通过控制上样量能助于提高整体超螺旋比例。
使用Pultrix™ XQ膜 （MV: 0.3 ml），按下表中实验条件进行实验：
上样过程中取流穿样，洗脱按峰收集后取样跑胶、测浓度、HPLC以及各项杂质检项，结果如下图：
实验结果表明，Pultrix™ XQ膜吸附器一步质粒捕获收率＞80%，超螺旋质粒比例＞90%，内毒素、HCD等杂质项也均能得到有效控制。
目前该项目已成功地在Pultrix™ XQ 95ml上实现稳定的线性放大，每批生产进行2个循环的，总工艺时长＜90 min。
成本、效率的比较：填料VS膜吸附器
对比传统质粒三步法纯化与 Pultrix™ 系列膜吸附器质粒纯化的成本和效率，如下图：
质粒膜吸附器一步法与传统三步法纯化成本对比
